超速离心机制备冷冻干燥保存菌种

细菌在普通培养基中保存一般需要 每月 传
 
代一 次 , 而且容易发生污染和变异 。 保存菌种**理想的方法为冷冻干燥法 , 可 以保存几 年、 几十年或者更长的时间 , 而且可 以避免污染和变
 
异j[1  。  但是 ,    冷冻干 燥设备昂贵 ,     不是每一 个必
 
需的单位都能装备上 ,  **使该法不能 普遍应用 。
 
我们通过试验发现 ,      利用超速离心机原有的低
 
温 冷冻系统和真空 抽气系统 ,  不 加任何改装 ,  可
 
以 完成冷冻干燥过程 ,  制备出冷冻干燥菌种 ,  效
 
果良好 提供了一个一机多用 的冷冻干燥方法。
 
1 材料和方法
L l _材料
 
^{.1 L l} 供试菌种 : 由中G药品生 物制品检定所菌种保存 中心提供 , 均为G际标准菌种 。
1. 1 .      2 培养_基:      _{普通营养琼脂培}养_基。
 
1. 1 .       3 超速离心 机 :      日立 08 P 一 7 型 超速离心 机
( _P r e  s  e r  v  a  t i v  e e e  n t r  i _f u  g e )
 
L L  4高频探漏仪 :  G P I 型 ,  北 京仪器厂出品 。
 
.1  2    _方法
 
L ^{.2   1}   新鲜脱脂牛乳的制 备:   制备冷冻干燥菌
 
种需用脱脂牛乳作保护剂。 制备方法 : 取⁴ ℃ 保藏的新鲜牛乳一袋 ^, 3 0 0 o r / m i ⁿ 离心 沉淀 I O m i n 去除油脂层。 取此脱脂牛乳分装于中试管 , 经 0 . 7 0 k g c/ m ^“ 高压蒸汽灭菌 , 塞上无菌胶塞 , 4 C 冰箱存放备用 。
 
¹ . ² .        ² 菌液制备:  将要冷冻干燥的菌种接种于
 
营养琼脂斜面 ,      37  ℃ 培育18  一 24  h 。  刮取菌苔放人³一 ^s lm 无菌脱脂牛乳中制成浓菌液 ⁽ 每毫升约含 20 亿个菌 以上 ) , 按0 . 1一。 . 2 m l 量分装于安瓶管中 , 进行冷冻干燥。
 
^{L  .2  3}    冷冻干燥操作程序:
 
( 1)  预冷 :   检查机器 ,    将各转钮调置于 。位。
 
将 低限温度指 针 ( 绿针) 调****低处 , 将高限温度指针 ( 红针 ) 调** 一 ^I O C 处 。 接上电源 , 打
 
开总开关和冷冻机开头 , 使槽 内温度下降。 约 20 m in , 槽 内温度可 降** 一 03 C , 温度指针 ( 黑
 
针 )  到达**低处。
 
(2 ) 菌种速冻: 当槽内温度到达一 03 C 以下时 , 启开冷冻槽平盖 , 迅速放人装有牛乳菌液的 安瓶管 , 并盖严平盖 , 继续冷冻h2 。
(3  ) 冷冻干燥 :      打开真空泵 ,      在一 03  C 下
 
抽 气干燥h2  。  将低限温度指针上调** 一 ⁴ ℃ ,     上
 
限 温度指针上调** 十 ^S C , 继续抽气干 燥h2 。 将低限温度指针上调** ^1 8 C , 上限温度指针上调** 24 C , 继续抽气干燥4h , 冷冻干燥完毕。 每次
 
使用后 ,  部分水气成为水珠下沉于油槽底部 ,  需
 
从油 槽下端换油 孔的透明胶管中放出 。  当放尽
 
水珠后 ,     补上一 些新油即可再次使用 。
 
( )4  封^口 ,    加签 :   关闭真空泵和冷冻机 ,     打
 
开 冷冻槽平盖 , 取 出冻干的安瓶管。 冷冻干燥 良好的菌种管原体积不变 , 呈白色干燥结构。 将安
 
瓶 管逐个插人真空抽气机的多头皮管上 , 用本生灯或安瓶封 口 灯火焰逐支封 口 。 按菌种名称
 和批号贴上标签 ,     置菌种盒于 ⁴ ℃ 冰箱保存待
用 。
 
( )5 检测: 用 G P ^I 型高频探漏仪探测每支菌种管的真空度。 真空 度良好的菌种管会发蓝
 
色荧光。  探测时间不宜过长 ,       以免影 响菌种活
 
力。 活菌试验 : 打开安瓶管 , 加人少量肉汤培养基 , 融化后取一滴接种于营养琼脂斜面上 , 或其他适宜培养基上 , 放 37 ℃ 温 箱 中培育 24 一 ⁴ 8 h ^, 观察细菌的存活情况及其纯度。
2 结果和讨论
 
2 .¹   超速离心机制备冷冻干燥菌种
 
两 年中用此法冷冻干 燥 G际 标准菌种03
 
种 ^,    包括痢疾杆菌、    沙门氏杆菌、    假单胞菌、    埃
 
希氏菌、 链球菌、 亚 利桑那沙门氏菌等属的细菌。 冻干保存一年后 随机测 试了 18 种冻干的菌
 
种 ^,     即 ^:    志贺氏痢疾杆菌、    宋内氏痢疾杆菌、    福
 
氏 痢疾杆菌、     伤寒杆菌、     肠炎沙门氏菌、     金 黄
 
色葡萄球菌、      甲型链球菌、     绿脓杆菌、     克雷伯
 
氏 肺炎杆菌、     致病性埃希氏大肠 杆菌、     亚利桑

那菌、  弗兰地柠檬酸杆菌和 腊状杆菌 。  结果全部
 
生长 良好 。
 
² . ² 超速离心机冻干其他生物制荆
 
实 验证明 ,      使用 此法将冷冻干燥时间延长
 
到 ^{1 4} h ,     还可 以冻干较大容量的各种生物制剂。
 
我们以人血清和 脱脂牛乳做试验 ,       ⁵m l 安瓶装
 
量 l m l ,      I O m l 安瓶装量 Zm l ,     底面积 2 5 X  4 5 m m
 
的组织培养瓶装量³ m l ,  底面积5  ^又 85  m m  的组
 
织 培养瓶装量^1 0 m l ,    平放冷冻干燥¹ h4  ,    可 以制
 
出 良好的冻干产 品。
 
由于本机冷冻槽较大 , 真空泵效力较高 , 使用本机不仅可以冻干菌种 , 使之长期保存 , 而
 
且还适用于 中批量的冻干生物制剂的研究和生
产 ,包括生物制剂 ,      生物药品和其他生物制品
 
的 研究和生 产。  一机 两用 ,      可 以节省 资金和 用
 
房 ,     提高机器的利用率。